关于对某疏水色谱填料的加工与实践分析

目前，我国还不能生产这种疏水色谱填料，全部依赖进口，价格高昂（美国Sigma公司产品价格为4.5美元/mL）。我国壳聚糖资源十分丰富，价格低廉，能否以壳聚糖为载体合成疏水色谱填料如何合成这种疏水色谱填料的特性如何对蛋白质分离提纯的效果如何有关这些问题的研究，迄今尚未见报道。对此，我们进行了试验研究，取得了一些初步结果。材料壳聚糖：脱乙酰度>90%，白色，分子量>80万，全溶于1%醋酸（HAC）；假单胞杆菌脂肪酶（PSL）粗品（日本天野制药株式会社产品）；正戊醛公司产品）；牛血清白蛋白（BSA）购自中科院上海生化所东风生化技术公司；其他试剂均为分析纯。PSL粗酶液的配制取1.5gPSL溶于缓冲液中，定容到100mL，在4℃冰箱中放置24h，并间歇振摇。然后以离心5min，收集上清液，即为脂肪酶的粗酶液脂肪酶的活力测定，采用碱滴定法测定。酶活力单位定义为：在37℃反应1min，从底物橄榄油中释放1mmol脂肪酸所需要的酶量，作为1个活力单位（U）。蛋白质浓度的测定根据的考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。用牛血清白蛋白（BSA）作标准曲线，样品须事先透析除去硫酸铵。正戊基壳聚糖的制备制备工艺为：壳聚糖→溶于1%HAC→加正戊醛，反应→抽滤→洗涤→得滤饼→还原→抽滤→洗涤，抽干→得正戊基壳聚糖。制得的正戊基壳聚糖，经过55℃烘干72h，即得干燥的疏水色谱填料。正戊基壳聚糖对蛋白质的吸附能力，对BSA的吸附容量称取上述0.71g干重的正戊基壳聚糖装色谱柱（I.D.10mm×120mm），床体积为6.0mL。用含2.0mol/L（NH4）2SO4的20mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液平衡，上一定量5mg/mLBSA溶液[事先与等体积4.0mol/L（NH4）2SO4的缓冲液混合]，用上述缓冲液洗脱，流速为0.6mL/min，分别测定上样前样品的蛋白质含量和穿过峰中总蛋白质含量。结果表明：有12.87mgBSA吸附在色谱柱上，则该疏水色谱填料对BSA的吸附容量为18.1mg/g干重疏水色谱填料。对PSL的吸附容量测定方法同上。测得吸附在色谱柱上的脂肪酶总蛋白量为1.57mg，而本试验用0.71g干重的正戊基壳聚糖装色谱柱，因此1g干重正戊基壳聚糖可以吸附2.2mg脂肪酶。同样，对PSL的活力也进行了测定。结果表明：每克干重正戊基壳聚糖可以吸附938.6U脂肪酶。正戊基壳聚糖在PSL分离提纯中的应用用上面合成的正戊基壳聚糖填充色谱柱进行HIC。此时柱床体积为5.8mL、流速为0.6mL/min、温度为20℃。取3mL粗酶液上样，用2mol/L硫酸铵的磷酸缓冲液洗脱，此时出现1个穿过峰。回到基线后，接着分别用1.6、1.2、0.8、0.4、0.0mol/L硫酸铵的磷酸盐缓冲液，进行阶段梯度洗脱。结果表明：PSL经过HIC后，被分成1个穿过峰和5个洗脱峰。分别收集各个洗脱峰，透析后，测定各个峰的酶活力和蛋白质浓度。